将二代测序（NGS）融入到主流实验室测试

保持行业领先地位在当今时代十分重要。作为创新的测序平台，二代测序（NGS）可以同时执行数百乃至数百万个测序反应，并分析测序结果数据。最近，美国联邦医疗保险和补助服务中心（CMS）最终决定将为晚期癌症患者使用的NGS诊断实验室测试纳入其中。这一决定无疑将加速NGS在临床诊断中的应用。

商用版实验室信息管理系统（LIMS）于1982年上市。此前数年，科学家就已经开始DNA测序，以帮助控制实验室流程，跟踪样本、实验室工作流和数据。在本文中，我们将讨论DNA测序如何发展到NGS，以及现代化的实验室测试如何提供更高质量的诊断测试和更有效的流程，以帮助简化DNA测序过程。

四十年前，DNA测序还是一个劳动密集型的手动过程，使用放射性物质，并只生成分离的DNA分子的序列。需要事先知道至少一小段DNA的碱基对序列，并将其作为引物，即测序酶的初始结合位点，然后生成此前未知的序列。新序列的末端将作为下一轮测序的引物。通过这种被称为桑格测序的方法，一段完整的基因可以同时进行几百个碱基对的测序。平均每段基因有1万到1.5万个碱基对长，因此不难理解这有多耗时，即便是在1987年的自动化技术出现之后。

NGS平台最早出现于本世纪初，它建立在桑格测序方法（扩增测序）的基础上，但能够同时执行数百到数百万个测序反应，还能同时分析生成的测序数据。与早期的DNA测序相比，今天的NGS平台生成大量数据，速度极快且相对便宜。成本的不断下降促进了NGS这一自动化DNA测序方式多种新的应用。就在十年前，这些应用的成本仍非常高。

如今，NGS已进入医疗领域，并越来越多地应用于临床诊断（即诊断测试）。常用的NGS过程，包括全外显子组测序、DNA靶向测序、RNA测序和染色质免疫沉淀测序，已经应用于研究或以患者为中心的创新过程的开发和发明中。

NGS拓宽了临床诊断测试的领域

应用NGS的临床诊断领域包括遗传疾病诊断、肿瘤、遗传咨询和传染病管理。FDA首次批准的NGS测试用于遗传疾病，具体是Illumina的MiSeqDx囊性纤维化139变异测试和MiSeqDx囊性纤维化临床测序分析。在临床肿瘤领域，NGS被用于肿瘤描述，以提供对疾病预后的洞察，并帮助给出治疗措施。NGS还为个性化医疗方法的开发提供支持，这些方法使用基于NGS的伴随诊断检测，并与已开发并被批准仅用于特异遗传性肿瘤患者的药物配合使用。因此，该技术也有助于更好地进行基因调控。

获得FDA批准的第一个NGS伴随诊断是Foundation Focus的CDxBRCA，其用于识别患有BRCA突变的卵巢肿瘤，且正在考虑使用Clovis Oncology的Rubraca（rucaparib）进行治疗的患者。FDA随后批准的两个NGS伴随诊断分别是Illumina的Praxis Extended RAS Panel， 用于识别有资格接受Vectibix治疗的结直肠癌患者，以及Thermo Fisher Scientific的Oncomine Dx靶标试验，用于选择有特定基因突变的非小细胞肺癌（NSCLC）患者。

FDA批准的测试需要遵循专门开发和验证过的方案。但即便是FDA批准的最直接的NGS测试方案也涉及复杂的、包含多个步骤和程序的工作流。一个基本的NGS工作流可能涉及多个实验室，它们执行不同的功能，包括样本制备、DNA库制备和扩增子测序。在此之前，需要进行样本的接收和录入；在此之后，必须先对结果数据进行分析再发布结果。

监管机构努力紧跟NGS的步伐

在美国，临床实验室受到多种监管机构的监督。医疗保险和补助服务中心通过《临床实验室改进修正案》（CLIA）规范实验室检测。此外，某些州一级的要求可能还更严格。还有美国病理学家协会（CAP）等实验室专业组织，为临床实验室制定最佳实践指南。随着分子技术的发展，美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）和分子病理学协会（AMP）等组织也进入该领域。

2015年，美国医学遗传学和基因组学学院和分子病理学协会发布了关于临床诊断基因检测解释的联合指南。 这些指南强烈建议在《临床实验室改进修正案》（CLIA）认证的实验室进行临床分子遗传学检测，同时涵盖了谁可以解释结果的具体内容。此外，这些指南还指出了进行结果确认的必要，如其所述，序列变异被认为是致病性的或可能是致病性的。1 该联合指南引用了美国医学遗传学和基因组学学院于2013年发布的一套专门针对NGS（自动DNA测序）的指南，其推荐了确证性试验的方法，并对开发、测试和验证方法以及报告标准提供了指导。

除美国医学遗传学和基因组学学院以外，美国病理学家协会于2014年在其分子病理学检查表中新增了18项实验室认可的检查要求。 这些要求适用于基于NGS的多个疾病领域的检测，包括遗传性疾病、分子肿瘤和传染病。这些要求还区分实验室的干湿区，并涉及关于NGS的众多主题，包括确证性诊断测试。

LIMS系统需要满足NGS工作流的复杂性要求，包括多方位的样本处理和实验室的多种规范。但它未必能被配置以管理完整的工作流。为了得出最终结果，NGS严重依赖于数据分析，其取决于扩增测序软件的初始评估。初步分析要求确定核苷酸链的各个拷贝的确切序列，将短读与重叠的较长读进行比对，然后比较各个读数以确认变体，同时考虑信号强度、错误和其他质量指标。临床NGS实验室应为识别的变体设定阈值，并解释这些变体是否具有临床意义或为良性。为实验室开发的诊断测试应保持高标准，具体而言，即保证低误报率。 

根据美国医学遗传学和基因组学学院的二代测序临床实验室标准，“建议所有以疾病为重点的和/或诊断检测都使用伴随技术进行最终结果的验证。” 期望将来只有使用成熟的且经过验证算法的、最有经验的NGS实验室可以考虑使用正交技术而免除验证性测试。因此，实验室转而采用桑格测序这一DNA最常用的技术，而不是执行所有类别变体都要求的、或许被视为NGS技术应用的广泛的验证。如同基因PANEL检测和其他靶向富集检测，“当前，建议所有以疾病为重点的高产基因检测完全覆盖每个被检测患者”，桑格测序因此尤其有用。同时，可以使用重复测试来验证其他检测，其常见于肿瘤组织分析或镶嵌变体，或在原位杂交（FISH）中使用荧光等伴随技术。